Le monde naturel est constitué de mélanges complexes, avec souvent jusqu’à 100 000 (par exemple, les protéines du corps humain) ou 1 000 000 (par exemple, le pétrole).
Chromatographie
Les méthodes de séparation nécessaires pour faire face à ces problèmes, ainsi qu’aux mélanges plus simples mais toujours difficiles rencontrés, par exemple dans l’analyse pharmaceutique, sont basées sur la chromatographie et l’électrophorèse, et sous-tendent la recherche, le développement et le contrôle de la qualité dans de nombreuses industries et dans l’analyse environnementale, alimentaire et médico-légale.
En chromatographie, un échantillon est dissous dans une phase mobile (il s’agissait initialement d’un liquide), qui est ensuite passée à travers une phase stationnaire (qui est soit un liquide, soit un solide) maintenue dans un tube de petit diamètre, la « colonne ».
Selon les différentes solubilités relatives dans les deux phases, les composants du mélange se déplacent à travers la colonne à des vitesses différentes et se séparent avant d’émerger et d’être détectés par la mesure d’une propriété chimique ou physique. La taille de l’échantillon peut être aussi petite qu’un picogramme (10 à 12 g), mais des dizaines de grammes peuvent être manipulés dans des séparations préparatives.
Histoire de chromatographie
La chromatographie couvre le XXe siècle : les séparations décrites par le botaniste russe Mikhaïl Tswett en 1903 par adsorption/désorption continue dans des colonnes ouvertes et garnies, couramment appliquées en chimie des produits naturels, ont été suivies par les travaux lauréats du prix Nobel (décernés en 1952) d’Archer John Porter Martin et Richard Laurence Millington Synge.
Tswett a appelé sa nouvelle technique « chromatographie » parce que le résultat de l’analyse était « écrit en couleur » sur toute la longueur de la colonne adsorbante (dans ce cas, la craie). En 1941, Martin et Synge ont remplacé l’extraction liquide-liquide par la chromatographie à partition liquide (LC), en soutenant la phase stationnaire liquide sur un support solide (à l’aide de gel de silice), sur lequel ils ont passé la solution de l’échantillon. Dans leur article, ils ont fait la célèbre déclaration suivante :
« La phase mobile n’a pas besoin d’être un liquide, mais peut être une vapeur… séparations très raffinées des substances volatiles devrait donc être possible dans une colonne dans laquelle un gaz permanent est fait couler sur un gel imprégné d’un solvant non volatil.
Cette prévision a conduit à la réalité de la chromatographie en phase gazeuse (CG), développée par Martin et son collègue Anthony T. James en 1952. Leur premier GC était composé d’un tube de verre contenant le matériau de support à travers lequel un mélange de gaz était soufflé par un gaz vecteur. Les analytes séparés dans le mélange ont été détectés à l’aide d’une technique de titrage simple.
La LC s’applique à toutes les substances solubles, tandis que la GC peut être appliquée aux composants du mélange qui peuvent être chauffés sans décomposition pour donner une pression de vapeur suffisante (mesurée en quelques millimètres de mercure, mmHg) pour que chaque soluté passe à travers la colonne dans un temps raisonnable.
La plage de volatilité de la GC peut être étendue par l’utilisation d’un fluide supercritique (une substance au-dessus de sa température et de sa pression critiques) en tant que phase mobile, la chromatographie en fluide supercritique (SFC). Il s’agit d’un meilleur solvant qu’un gaz et plus diffusif qu’un liquide, ce qui permet une analyse plus rapide. L’électro chromatographie capillaire (CEC) combine les avantages de la LC et de l’électrophorèse.
L’écoulement en phase mobile est maintenu par un champ électrique plutôt que par une pression appliquée ; Le principe de séparation est à nouveau celui de la partition, mais l’effet de différents taux d’électro migration peut être superposé dans les applications aux analytes chargés.
La chromatographie de partage précoce a été réalisée dans des colonnes avec un support inerte sur lesquelles la phase stationnaire était soit enduite, soit mieux collée. En 1958, M.J.E. Golay a montré comment un chemin tortueux à travers un lit bondé pouvait être remplacé par un chemin beaucoup plus droit à travers un tube étroit et ouvert.
Des longues colonnes, et donc très efficaces, ont ainsi pu être fabriquées avec la phase stationnaire sur la paroi intérieure, et des séparations remarquables ont été réalisées par GC et plus tard par SFC. LC a pris une voie différente, car la diffusion lente dans les liquides signifie que les séparations dans les tubes ouverts nécessitent des diamètres trop petits. L’augmentation de l’efficacité peut être obtenue plus simplement sur des colonnes remplies de petites particules de silice avec des groupes organiques liés.
L’instrumentation commerciale initiale de la GC était basée sur des colonnes en verre, et le chromatographe en phase gazeuse le plus célèbre était l’instrument Pye 104 avec un détecteur à ionisation de flamme.
Le couplage direct de la chromatographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse à temps de vol (TOF) a été réalisé au milieu des années 1950 en collaboration avec W.C. Wiley, I.H. McLaren et Dan Harrington de la Bendix Corporation.
À peu près à la même époque, la GC a été couplée à un instrument à secteur magnétique. La grande utilité de la GC-MS moderne a été rendue possible par l’avènement, dans les années 1960, de séparateurs de gaz porteurs qui éliminaient le gaz porteur GC avant l’introduction d’un échantillon dans le spectromètre de masse à vide poussé.
En 1979, l’article de Ray Dandeneau de Hewlett Packard annonçait au monde le développement des colonnes de silice fondue. Les colonnes capillaires ont plus de plaques théoriques (une mesure du pouvoir de résolution ou de l’efficacité de la colonne) par mètre par rapport aux colonnes garnies et, comme elles ont moins de résistance à l’écoulement, elles peuvent être plus longues que les colonnes garnies.
Cela signifie qu’une colonne capillaire moyenne de 30 mètres comporte environ 100 000 plaques théoriques, tandis que la colonne garnie moyenne de 2 mètres n’en compte que 2500.
HPLC
La chromatographie liquide à haute pression (HPLC) a été développée au milieu des années 1970 et s’est rapidement améliorée avec le développement de matériaux d’emballage sphériques en silice et du détecteur UV de petit volume.
À la fin des années 1970, la chromatographie liquide en phase inverse a permis d’améliorer la résolution et la technique a été largement acceptée dans l’industrie pharmaceutique.
Dans les années 1980, l’HPLC était couramment utilisée pour la séparation de petites molécules. De nouvelles techniques d’instrumentation ont amélioré la séparation, l’identification et la quantification bien au-delà des techniques précédentes. Les ordinateurs et l’automatisation ont ajouté à la commodité de la HPLC.
Depuis 1990, il y a eu un mouvement continu des colonnes de 4,6 millimètres de diamètre intérieur des années 1970 et 1980 vers des colonnes de micro-alésage dont le diamètre intérieur varie entre 1 et 3 millimètres. Aujourd’hui, cela se déplace dans des colonnes capillaires allant de 3 à 200 microns. Ces colonnes capillaires ont fourni une interface plus facile avec le spectromètre de masse qui devient maintenant très rapidement le détecteur de choix pour LC.
Formes de chromatographie
D’autres formes de chromatographie sont :
| Chromatographie sur couche mince et sur papier. Développé pour la première fois dans les premiers travaux de Martin et Synge, où une couche d’absorbant est étalée sur une plaque de verre et des mélanges de composants sont placés sur le bord de la plaque. On laisse ensuite le solvant remonter sur la plaque par capillarité, en entraînant les composants du mélange à des degrés divers. | |
| Chromatographie par perméation de gel. Les composés sont séparés en fonction de leur taille moléculaire. | |
| Chromatographie par échange d’ions. Séparation des ions en fonction de leur charge à l’aide d’un matériau de support chargé. |
L’électro chromatographie, l’électrophorèse capillaire (CE et CZE), l’électrophorèse sur gel capillaire (CGE), la chromatographie capillaire électrocinétique micellaire (MECC) et l’électro chromatographie capillaire (CEC).
Sont de nouvelles techniques de séparation utilisant des tensions élevées et des capillaires à alésage étroit, elles sont toutes regroupées dans le domaine de l’électro chromatographie.
Cette technique utilise les principes et les avantages de l’écoulement électro-osmotique.