Méthodes et techniques d’étude de la cellule

 01-Aspect morphologique pour étudier la cellule

Méthodes optiques d’examen peuvent se pratiquer de deux manières :

Étude de cellules vivantes, soit directement dans l’organisme (examen vital) grâce à l’utilisation de colorants non nocifs ou vitaux, soit isolées à partir de fragments de tissus, examen supravital.

Étude de cellules préalablement tuées suivant de diverses méthodes qui conservent leur morphologie et leur composition, dans un état aussi voisin que possible du vivant (fixation ou congélation). Le plus couramment, les observations se font au microscope photonique ou au microscope électronique.

Microscope photonique pour étudier la cellule

Le pouvoir séparateur de l’œil humain est de l’ordre de 200µm à 25cm,l’œil ne peut distinguer que deux points voisins distants de 0,2 mm environ, alors que la taille moyennedes cellules est bien inférieure(1à10µ pour une bactérie 10µ à 30µ pour une cellule animale ou végétale), or au microscope photonique le pouvoir séparateur peut être abaissé à 0,2µ en lumière visible, et le grossissement maximal courant utilisable est de 1000 fois (2000 à 2500 fois pour des appareils très perfectionnés).

L’observation au microscope par transmission exige, pour que la lumière puisse traverser les objets, que ceux-ci soient de faible épaisseur (2 à 5µ environ) et convenablement contrastés.

Les microscopes photoniques se prêtent mieux à une étude des tissus et de leur organisation générale (histologie) qu’a celle des cellules (cytologie), en effet en dehors du noyau les structures cytoplasmiques ne sont pas identifiables.

Cependant, les microscopes à lumière   demeurent, par leur taille et leur prix, l’instrument de base le plus utilisé pour la recherche courante.

La microscopie électronique est la méthode de choix pour la cytologie, en pratique le pouvoir séparateur obtenu est de l’ordre de 01 nm (10 A°), 200 fois supérieur à celui du microscope photonique, permettant ainsi de pousser l’exploration au niveau des ultra structure cellulaire.

La lumière est remplacée par des électrons émis par une cathode (filament de tungstène) et accélérés dans le vide par une forte différence de potentiel (40000 à 100 000 volts pour un microscope normal à bas voltage, 2 à 3 millions de volts pour un microscope à haut voltage).

Le faisceau d’électrons ne peut traverser les objets que d’une extrême minceur (50 à 80 nm ce qui représente 400 coupes environ dans une cellule de 20µ de diamètre) Le TEM a permis de préciser la structure de tous les organites cellulaires, de certaines macromolécules (ADN, ARN), comme il a mis en évidence l’uniformité qui existe dans le monde vivant au niveau des structures cellulaires.

Microscopes à balayage (SEM) pour étudier la cellule

Plus récemment mis au point, un faisceau d’électrons balaye la surface de l’échantillon préalablement métallisé, le faisceau d’électrons est réfléchi (ne pénètrent pas dans l’échantillon) Il peut parcourir de grands champs d’observation et étudier la surface échantillons massifs, d’où la vue tridimensionnelle des surfaces cellulaires.

02-Aspect constitution physico-chimique pour étudier la cellule

Microsonde électronique pour étudier la cellule

Frappés par un faisceau d’électrons, les objets émettent des rayons X, dont la longueur d’onde est caractéristique des atomes bombardés, les spectrographes détectent et mesurent ces longueurs d’ondes et permettent de déterminer la composition chimique de volume extrêmement petit de matière (1µ³). Il est possible ainsi de réaliser dans le même temps l’étude morphologique et l’analyse chimique d’une structure.

Cytochimie

la méthode consiste à immobiliser (fixer) la substance dans son site original, et à l’identifier par une technique spécifique à l’aide de réaction chimique.

Les colorants acides se fixent sur les substances basiques, les colorants basiques sur les substances acides.(Ex : basophilie du réticulum endoplasmique granulaire riche en acide ribonucléique)

Le fractionnement cellulaire

Il permet de séparer les différents organites cellulaires, elle s’effectue en deux étapes principales :

Le broyage d’un fragment de tissu qui s’effectue à 0°C en milieu isotonique tamponné, ce qui permet d’obtenir un homogénat dans lequel sont dispersés les constituants cellulaires.

La centrifugation de l’homogénat pour isoler les différents constituants cellulaires.

Diffraction au rayonnement (rayons x)

Est une technique d’analyse fondée sur la diffraction des rayons X sur la matière. La diffraction n’ayant lieu que sur la matière cristalline, on parle aussi de radiocristallographie.

Pour les matériaux non cristallins, on parle de diffusion-Cette méthode utilise un faisceau de rayons X qui rencontre la matière, provoquant la dispersion du faisceau lumineux dans des directions spécifiques.

Par la mesure des angles et de l’intensité des rayons réfractés, il est possible d’obtenir une image tridimensionnelle de la densité électronique dans le cristal. À partir de cette densité, la position moyenne des atomes du cristal peut être déterminée, ainsi que leurs liaisons chimiques,

03-Aspect fonctionnel pour étudier la cellule

Ces méthodes peuvent être utilisées in vivo (sur l’animal vivant) ou in vitro (sur fragment de tissu ou sur cellules maintenus vivants en culture).

Culture in vitro

Elle permet d’isoler un tissu ou des cellules vivantes de l’organisme, et étudier leur comportement dans des conditions expérimentales modifiables à volonté.

Microchirurgie

Par l’intermédiaire d’un micromanipulateur, cette méthode permet d’effectuer une série d’interventions directes (ablation, greffes).

Autoradiographie

Elle permet de déterminer :

Le site de synthèse d’une molécule.

La cinétique de cette molécule au cours de la vie cellulaire.  Et ça en utilisant de précurseurs du métabolisme marqués avec des isotopes radioactifs.

Ces précurseurs marqués sont incorporés par les cellules au même titre que les précurseurs naturels, ils sont ensuite localisés au niveau des molécules néosynthétisées.