-Les principales méthodes et techniques dont dispose actuellement la biologie cellulaire sont reparties en trois aspects.
01 – Aspect morphologique :
-Les méthodes optiques d’examen peuvent se pratiquer de deux manières :
-étude de cellules vivantes, soit directement dans l’organisme (examen vital)
grâce à l’utilisation de colorants non nocifs ou vitaux,
soit isolées à partir de fragments de tissus, examen supra vital.
-étude de cellules préalablement tuées suivant des méthodes diverses qui conservent leur morphologie et leur composition,
dans un état aussi voisin que possible du vivant (fixation ou congélation)
-Le plus couramment, les observations se font au microscope photonique ou au microscope électronique.
A– Microscope photonique : le pouvoir séparateur de l’œil humain est de l’ordre de 200µm à 25cm,
l’œil ne peut distinguer que deux points voisins distants de 0,2mm environ,
alors que la taille moyenne
des cellules est bien inférieure
(1à10µ pour une bactérie 10à30µpour une cellule animale ou végétale) ,
or au microscope photonique le pouvoir séparateur peut être abaissé à 0,2µ en lumière visible ,
et le grossissement maximal courant utilisable est de 1000fois (2000 à 2500 fois pour des appareils très perfectionnés) .
-L’observation au microscope par transmission exige,
pour que la lumière puisse traverser les objets,
que ceux-ci soient de faible épaisseur (2 à 5µ environ) et convenablement contrastés.
-Les microscopes photoniques se prêtent mieux à une étude des tissus et de leur organisation
générale (histologie) qu’a celle des cellules (cytologie),
en effet en dehors du noyau les structures
cytoplasmiques ne sont pas identifiables.
Cependant les microscopes à lumière demeurent,
par leur taille et leur prix, l’instrument de base le plus utilisé pour la recherche courante.
-La microscopie électronique est la méthode de choix pour la cytologie ,
en pratique le pouvoir séparateur obtenu est de l’ordre de 01nm (10A°) ,
200 fois supérieur à celui du microscope photonique ,
permettant ainsi de pousser l’exploration
au niveau des ultra structure cellulaire .
-La lumière est remplacée par des électrons émis par une cathode (filament de tungstène) et
accélérés dans le vide par une forte différence de potentiel
(40000 à 100000 volts pour un microscope normal à bas voltage,
2 à 3 millions de volts pour un microscope à haut voltage) .
-Le faisceau d’électrons ne peut traverser les objets que d’une extrême minceur
(50 à 80nm ce qui représente 400 coupes environ dans une cellule de 20µ de diamètre)
Le TEM a permis de préciser la structure de tous les organites cellulaires ,
de certaines macromolécules(ADN , ARN),
comme il a mis en évidence l’uniformité qui existe dans le monde vivant au niveau des structures cellulaires .
B 2 – microscopes à balayage (SEM)
-Plus récemment mis au point, un faisceau d’électrons balaye la surface de l’échantillon préalablement métallisé,
le faisceau d’électrons est réfléchi (ne pénètrent pas dans l’échantillon)
Il peut parcourir de grands champs d’observation et étudier la surface
d’échantillons massifs,
d’où la vue tridimensionnelle des surfaces cellulaires.
02 – Aspect constitution physico-chimique :
a– microsonde électronique : frappés par un faisceau d’électrons, les objets émettent des rayons X,
dont la longueur d’onde est caractéristique des atomes bombardés,
les spectrographes détectent et mesurent ces longueurs d’ondes et permettent de déterminer la composition
chimique de volume extrêmement petit de matière (1µ3). Il est possible ainsi de réaliser dans le même temps
l’étude morphologique et l’analyse chimique d’une structure.
b– la cytochimie : la méthode consiste à immobiliser (fixer) la substance dans son site original,
et à l’identifier par une technique spécifique à l’aide de réaction chimique.
-Les colorants acides se fixent sur les substances basiques, les
colorants basiques sur les substances acides.
(Ex : basophilie du réticulum endoplasmique granulaire riche
en acide ribonucléique)
c – le fractionnement cellulaire : il permet de séparer les différents organites cellulaires, elle s’effectue en deux étapes principales :
– Le broyage d’un fragment de tissu qui s’effectue à 0°C en milieu isotonique tamponné,
ce qui permet d’obtenir un homogénat dans lequel sont dispersés les constituants cellulaires.
– La centrifugation de l’homogénat pour isoler les différents constituants cellulaires.
d – Diffraction au rayonnement (rayons x) :
-Est une technique d’analyse fondée sur la diffraction des rayons X sur la matière. La diffraction n’ayant lieu que sur la matière cristalline,
on parle aussi de
radiocristallographie.
Pour les matériaux noncristallins, on parle de diffusion
-Cette méthode utilise un faisceau de rayons X qui rencontre la matière
provoquant la dispersion du faisceau lumineux dans des directions spécifiques.
Par la mesure des angles et de l’intensité des rayons réfractés,
il est possible d’obtenir une image tridimensionnelle de la densité électronique dans le cristal. À partir de cette densité,
la position moyenne des atomes du cristal peut être déterminée,
ainsi que leurs liaisons chimiques,
03 – aspect fonctionnel : (le fonctionnement de la cellule)
Ces méthodes peuvent être utilisées in vivo (sur l’animal vivant) ou
in vitro (sur fragment de tissu ou sur cellules maintenus vivants en culture)
a- culture in vitro : elle permet d’isoler un tissu ou des cellules vivantes de l’organisme,
et étudier leur comportement dans des conditions expérimentales modifiables à volonté.
b- la microchirurgie : par l’intermédiaire d’un micromanipulateur cette méthode permet d’effectuer une série d’interventions directes (ablation, greffes)
c- l’autoradiographie : elle permet de déterminer :
-Le site de synthèse d’une molécule.
-La cinétique de cette molécule au cours de la vie cellulaire. Et ça en utilisant de précurseurs du métabolisme marqués avec des isotopes radioactifs.
Ces précurseurs marqués sont
incorporés par les cellules au même titre que les précurseurs naturels,
ils sont
ensuite localisés au niveau des molécules néo synthétisées.
